產品名稱： 斑馬魚磷酸化組蛋白H2AX（γH2AX）ELISA檢測試劑盒

 

檢測方法： 雙抗體夾心酶聯免疫吸附法

 

保存： 2-8℃保存，有效期詳見外包裝。標準品、生物素化抗體、辣根過氧化物酶標記親和素需按說明書要求分裝保存于-20℃。

 

規格： 96T

 

一、檢測原理

 

本試劑盒采用雙抗體夾心ELISA法。用抗斑馬魚γH2AX抗體包被微孔板，制成固相載體。向包被的微孔中依次加入樣品或標準品、生物素標記的抗斑馬魚γH2AX抗體，再與辣根過氧化物酶標記的親和素結合。經過徹底洗滌后，加入底物TMB進行顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的斑馬魚γH2AX濃度呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度，通過標準曲線計算樣品中斑馬魚γH2AX的濃度。

 

二、樣品收集、處理及保存方法

 

組織勻漿：取適量斑馬魚組織（如胚胎、肝臟、腦等），用預冷的PBS（0.01M，pH 7.4）沖洗，除去多余水分。將組織剪碎，加入一定量的PBS（如1:9重量體積比），用勻漿器在冰上充分勻漿。隨后，2-8℃下5000×g離心5-10分鐘，取上清液立即檢測或分裝于-20℃/-80℃保存，避免反復凍融。

 

細胞培養上清液：收集斑馬魚細胞培養液，2-8℃下1000×g離心20分鐘，取上清液立即檢測或分裝保存。

 

其他生物體液：如血液、血清、血漿等，需按常規方法處理后檢測。血漿樣本需用EDTA或檸檬酸鈉抗凝，不建議使用肝素。

 

三、試劑盒組成

四、操作步驟

 

準備：

 

從冰箱中取出試劑盒，室溫平衡20-30分鐘。

 

用蒸餾水將20×濃縮洗滌液稀釋至1×工作液備用。

 

用標準品稀釋液梯度稀釋標準品。注意：此步驟至關重要，請嚴格按說明書要求的濃度（例如：0, 10, 20, 50, 100, 200 pg/mL）和體積進行操作。

 

將生物素化抗體、酶結合物工作液按需稀釋（如果需要）。

 

加樣：

 

設置標準品孔、待測樣品孔和空白孔?？瞻卓准訕悠废♂屢骸?

 

標準品孔：加入不同濃度的標準品100μL。

 

待測樣品孔：加入適當稀釋的待測樣品100μL。輕輕晃動混勻。

 

溫育：

 

用封板膜封板，置于37℃溫箱或水浴鍋中，溫育60-90分鐘（具體時間見說明書）。

 

加抗體：

 

棄去液體，甩干，無需洗滌。

 

每孔加入生物素化抗體工作液100μL，封板膜封板，37℃溫育30-60分鐘。

 

洗滌：

 

棄去孔內液體，甩干，用洗滌液加滿每孔，靜置30秒后棄去，在厚疊吸水紙上拍干。重復此步驟3-5次。

 

加酶結合物：

 

每孔加入辣根過氧化物酶標記的親和素工作液100μL，封板膜封板，37℃溫育30分鐘。

 

洗滌：

 

重復步驟5的洗滌過程5次，確保洗滌徹底。

 

顯色：

 

每孔依次加入底物溶液A、B各50μL（或直接加入已混合的TMB 100μL），37℃避光顯色10-20分鐘。注意觀察：標準品孔出現明顯的藍色梯度時即可終止。

 

終止與測定：

 

每孔加入終止液50μL，此時藍色立即轉為黃色。

 

以空白孔調零，在加入終止液后15分鐘內，用酶標儀在450nm波長下測量各孔的吸光度值。

 

五、結果計算

 

以標準品的濃度為橫坐標，對應的OD值為縱坐標，繪制標準曲線（推薦使用四參數或二次多項式擬合）。

 

將樣品的OD值代入標準曲線方程，計算出樣品濃度。

 

如果樣品在檢測前進行了稀釋，計算出的濃度需乘以對應的稀釋倍數。

 

六、注意事項

 

安全：試劑盒中的終止液為酸性溶液，避免與皮膚、黏膜接觸。

 

準確性：請在有效期內使用試劑。不同批號的試劑組分請勿混用。

 

加樣：加樣時盡量不觸及孔壁，加樣時間盡量短，保持實驗的一致性。

 

溫育：為獲得最佳結果，請確保溫育時微孔板完全被水浴鍋或溫箱覆蓋，以保證溫度均一。

 

洗滌：洗滌不徹底是導致結果不準確的關鍵因素，必須確保充分洗滌和拍干。

 

顯色：TMB對光和氧敏感，請避光保存，并在規定時間內完成檢測。顯色時間可根據標準品孔的顏色深淺適當調整。

 

樣品：避免使用嚴重溶血、高血脂或已被污染的樣品。組織樣本建議設置陽性對照（如經輻照或藥物處理的樣本）。

 

七、靈敏度、精密度與特異性

 

最低檢測限：通常 < 1.0 pg/mL。

 

回收率：樣本中添加標準品的回收率應在80%-120%范圍內。

 

批內/批間精密度：板內、板間變異系數（CV）均應小于10%。

 

特異性：本試劑盒可特異性檢測天然和重組的斑馬魚γH2AX蛋白，與人、大鼠、小鼠等物種的γH2AX交叉反應性<1%。

 

八、應用

 

本試劑盒用于定量檢測斑馬魚組織、細胞裂解液或其他相關生物液體中內源性γH2AX的濃度。γH2AX是DNA雙鏈斷裂的標志物，廣泛應用于評估斑馬魚在遺傳毒理學、放射生物學、環境毒理學、抗癌藥物篩選等領域中的DNA損傷與修復響應。

 

再次提醒，本說明書為通用模板，操作前請務必閱讀并遵循您所購試劑盒附帶的實際說明書。